MEF小鼠胚胎成纖維細胞

　　規格：1*10 6

　　注意事項：

　　1.收到細胞后，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

　　2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩定細胞狀態。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據。

　　3.由于細胞狀態受環境、操作和運輸等多方面因素影響，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內的細胞狀態，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發現問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

　　4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

　　細胞介紹

　　取孕9天的615小鼠胚胎，去除腦、心臟等培養建立。該細胞可用作飼養層細胞，支持胚胎干細胞ES的生長并維持ES未分化的狀態。當作為飼養層細胞時，MEF需經絲裂霉素C處理停止生長。建議作為ES細胞的飼養層時，MEF不要超過6代。

　　細胞特性

　　1）來源：小鼠胚胎

　　2）形態：成纖維細胞樣，貼壁生長

　　3）含量：>1x106個/mL

　　4）污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

　　5）規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　運輸和保存

　　可選擇干冰運輸及發送復蘇存活細胞方式

　　（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復蘇；

　　（2）存活細胞，收到后應繼續生長，傳代達到細胞生長狀態良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養步驟。

　　（3）收到細胞后請拍照，3天內如果發現污染，請及時拍照與我們聯系。

　　細胞用途：僅供科研使用。

　　細胞接收后的處理

　　1）收到細胞后，請檢查發貨培養瓶的狀況，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

　　2）在顯微鏡下確認細胞生長狀態時，最，hao在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳代密度。看細胞的形態請在10X和20×物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態的依據。

　　3）觀察好細胞狀態后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h。

　　4）貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現象，如發現貼壁細胞有脫落或者脫落后抱團生長，可將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基的原培養瓶中（或新的培養瓶中）。

　　5）懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養基和細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養瓶中（加入按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基）。

　　6）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。收到細胞后第1次傳代建議1：2傳代。

　　細胞培養步驟

　　一．培養基及培養凍存條件準備

　　1）準備D/F12培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

　　2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

　　二．細胞處理

　　1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

　　2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

　　對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法

　　1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

　　3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

　　4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

　　注：第1次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據客戶需要自己決定。

　　3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

　　下面T25瓶為類；

　　1，細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養基終止消化，可使用血球計數板計數。

　　2，4min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據細胞數量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。

　　3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。