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流式檢測大致分為流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞周期檢測、細(xì)胞增殖檢測、細(xì)胞因子檢測

一、流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,F(xiàn)CM):

    

    就是對在高速流動的鞘液包裹下的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù),這種細(xì)胞或粒子是經(jīng)過特異熒光標(biāo)記的。其特點是測量速度快,每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細(xì)胞,且可進(jìn)行多參數(shù)測量,另一特點是在分析的同時可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來,這就是分選技術(shù)。

重要參數(shù):前向角散射(FSC):前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān),也就是說,同一個細(xì)胞群體,F(xiàn)SC強(qiáng)的,其細(xì)胞大一些,而FSC弱的,其細(xì)胞小一些。側(cè)向角散射(SSC):側(cè)向角散射又稱90°散射或大角散射。側(cè)向角散射光對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感,對胞內(nèi)較大的顆粒也會有反應(yīng)。所以,側(cè)向角散射光的強(qiáng)弱可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。熒光信號(FL):是細(xì)胞或細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光,不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。通過熒光強(qiáng)度可將同一個細(xì)胞群體中的有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開來,也就是我們通常所說的陽性細(xì)胞,也可以將陽性細(xì)胞中的高FL的細(xì)胞與低FL的細(xì)胞區(qū)分開來,也就是可以把強(qiáng)陽性細(xì)胞和弱陽性細(xì)胞區(qū)分開來。一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個激光光源(488nm),可測出三個FL,即FL1、FL2、FL3。FL2-W指檢測熒光的脈沖寬度,區(qū)分單個細(xì)胞和雙聯(lián)體細(xì)胞FL2-H指脈沖高度,細(xì)胞單位面積上的熒光濃度FL2-A指脈沖面積,即細(xì)胞熒光總和


二、細(xì)胞周期檢測:

  

  細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨著細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化。利用PI標(biāo)記的方法,通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)DNA的相對含量進(jìn)行測定,可分析細(xì)胞周期各時相的百分比,反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)和非二倍體(異倍體)的DNA含量。其中PI即碘化丙錠,可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合,采用RNA抑制劑將RNA消化后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。


第三、細(xì)胞增殖檢測


    示蹤染料標(biāo)記法:示蹤染料能與細(xì)胞發(fā)生非特異性的穩(wěn)定結(jié)合,主要有兩種結(jié)合方式:進(jìn)入胞內(nèi)與蛋白質(zhì)共價結(jié)合,如CFSE和BRSE;嵌入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,與細(xì)胞非公價結(jié)合,如PKH類和CellVue類等。CFSE是活細(xì)胞染料,又稱 CFDA-SE或 CFDA,其標(biāo)記細(xì)胞后對細(xì)胞毒性小,被激發(fā)后能發(fā)出很強(qiáng)熒光,且非常穩(wěn)定,只有當(dāng)細(xì)胞分裂時,母細(xì)胞內(nèi)的染料會被平均分配到子細(xì)胞中,細(xì)胞的熒光信號減少一半,細(xì)胞分裂代數(shù)越多,信號降低程度越大。


第四、細(xì)胞因子檢測


    細(xì)胞因子是一類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)等功能的蛋白或小分子多肽。根據(jù)功能可分為六大類:白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子。胞內(nèi)細(xì)胞因子:胞內(nèi)染色法( intracellularstaining assay);胞間細(xì)胞因子:CBA法(cytometric bead assay,流式微球陣列)。其優(yōu)點為單細(xì)胞水平,可多參數(shù)檢測。


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